微血管灌注肿瘤细胞粘附模型建立及粘附机制的活体内研究

【摘要】肿瘤远处转移复杂的过程中,涉及肿瘤细胞从原发部位的迁出和肿瘤细胞在转移部位的植入,往往是肿瘤细胞通过淋巴系统和血源的浸润、扩散而转移,其特点具有一定选择性、隐蔽性、危害最大。因此肿瘤血源转移过程的研究日益受重视,而肿瘤细胞粘附到靶器官的微血管在肿瘤的血源转移过程中起着至关重要作用。虽然有体内、体外的大量肿瘤细胞粘附研究,但是并没有理想的研究方法或模型,能够在哺乳动物活体的微血管中不破坏微血管的生理环境和血流动力的情况下,直接研究肿瘤细胞的粘附特点,以及相关粘附因子、血流因素、血管通透性的变化与粘附相互作用影响。同时也有大量的研究白细胞对微血管相互作用的影响,但是肿瘤细胞在微血管粘附过程中,对微血管改变和影响机制相关研究报道较少。本研究基于以往本实验室的哺乳动物大鼠肠系膜微血管的穿刺技术,首次通过建立起一种新型活体微血管灌注肿瘤细胞,能够有效控制肿瘤细胞的粘附相关的因素,直接观察活体内微血管壁粘附的情况的实验模型,并建立其相关评价方法。通过对恶性肿瘤乳腺癌细胞进行微血管灌注观察,重点是在阐明微血管细胞粘附因子、微血管的通透性、血流产生的机械因素与肿瘤细胞微血管粘附的作用影响关系。同时进一步研究肿瘤的粘附对微血管产生的影响,通过测定大鼠肠系膜活体内肿瘤细胞粘附微血管后对血管的水和血清白蛋白大分子的溶液通透性,并利用的内皮细胞间隙相关的数学模型,计算水及白蛋白的溶液的通透性与微血管结构变化关系,推断肿瘤细胞粘附促使微血管重要屏障内皮细胞糖萼(EndothelialGlycocalyxLayer,EGL)减少,甚至消失。通过微血管活体灌注对EGL的蛋白硫酸乙酰肝素(HS)的免疫荧光染色,测定EGL破坏程度,阐明肿瘤的细胞粘附后突破微血管内皮细胞屏障和溢出到微血管外基质的机理。通过阻断肿瘤粘附过程相关粘附分子、血流、血管的通透性及其他影响,保护的血管中的EGL,可能有效地防止肿瘤细胞微血管粘附的血源转移,为肿瘤转移提供新的治疗思路。在肿瘤根治术后的化疗、放疗应该不仅仅要杀死肿瘤细胞,同时也考虑减少和消除肿瘤粘附相关因素,如保护微血管EGL等,减少远处转移,将为今后的分子靶向治疗提供更广阔的前景和空间,肿瘤的治疗效果将获得极大的提高。本研究主要分3部章,分别阐述如下：第一部分微血管灌注肿瘤细胞粘附的大鼠实验模型建立目的：建立起一种新型活体单微血管灌注肿瘤细胞模型,控制不同肿瘤细胞的粘附因素,肿瘤细胞在活体内微血管壁的粘附实时观察,并建立其相关评价的体系,为进一步后续的肿瘤粘附研究提供模型基础。方法：通过不同直径玻璃微针、不同灌注压力和不同时间对细胞的体外灌注测定其活性,确定制作合适的注射玻璃微针。雌性Spague-Dawle(SD)大鼠肠系膜单微血管的穿刺肿瘤细胞灌注技术,观察对肿瘤细胞不同压力的灌注速度,不同速度下的灌注数量,通过肿瘤细胞荧光染色,CCD相机记录实验的过程,读取粘附数量。再以此为基础,灌注不同MDA-MB-231、MDA-MB-435s,正常乳腺上皮细胞,整合素β4野生型(WT)和β4整合素基因剔除乳腺癌细胞(1355T),判断其肿瘤细胞间在微血管粘附的区别。结果：1)不同直径、压力和时间微针灌注的细胞成活率直径和时间均对肿瘤细胞的成活率有影响,但是程度有所不同。在微针直径30μm时候,灌注前和灌注60分钟后成活率无显著差异。灌注玻璃微针直径约301μm直径时,能够保持肿瘤细胞最大程度的活性,减少操作过程对肿瘤细胞的损伤。2)肿瘤细胞在微血管的中的速度我们测定三个速度组,结果显示实验所需的速度250μm/s其灌注压力控制在0.5cmH20以下,1000μm/s灌注压控制在2crnH20左右,而速度为2500μm/s,其灌注压应该在5cmH2O水平3)测定细胞在不同的速率下细胞灌注数量细胞的在微针尖为301μm的情况下,在肿瘤细胞60分钟玻璃微针的灌注数量,不同的速度组的细胞灌注,高速度组(>2500gm/s)大约为5770±158.75个,正常速度组(～1000μm/s)为2913±443.3个,低速度组(<250μm/s)是471±33.89个。4)不同肿瘤细胞粘附对比正常乳腺管上皮细胞,粘附几乎没有在微血管上粘附,肿瘤细胞的粘附要显著多于正常上皮细胞。MDA-MB-435s灌注1小时后的单位面积5000μm2粘附数量是2.90±0.51个,但是MDA-MB-435s明显少于其他三种MDA-MB-231是5.65±0.7个、WT5.56±0.65个、1355T粘附数量5.87+0.31在微血管的粘附数,后三者无显著差异。结论：通过建立起一种新型活体单微血管灌注肿瘤细胞,并建立其相关评价的体系,能够研究显微镜下直接观察,动物活体内研究模型；不破坏其生理环境下,实时观测肿瘤细胞的粘附变化；可以有效的控制微血管中灌注细胞数量、速度、流体因素、血管的渗透性等条件的进行研究,控制不同肿瘤细胞的粘附因素的肿瘤细胞在活体内微血管壁的粘附的实验模型。第二部分VEGF以及剪切力对肿瘤细胞微血管粘附影响目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)和剪切力对正常微血管中粘附情况影响。方法：1)与前述模型相同,通过雌性SD大鼠肠系膜单微血管的穿刺技术,微血管中的灌注浓度为4×106/ml的MDA-MB-435s细胞1%BSA-Ringer悬浮液,保持灌注速度1000μm/s,灌注时间为1小时。通过不同的处理组,来观察肿瘤粘附情况：分为：对照组、1nMVEGF、VEGF抗体(Anti-VEGF)、VEGF受体的阻滞剂SU-1498预处理、SU-1498预处理微血管后加入VEGF组。2)不同速度的对肿瘤细胞粘附的影响不同的速度灌注细胞分为低速度组2001μm/s、正常速度组1000μm/s、高速度组2500μm/s三组,测定1小时肿瘤细胞粘附。3)VEGF影响血管通透性的测定测定微血管0.1mg/ml荧光素钠溶液血管通透性(Permeability,P),分组为BSA-BSA-VEGF组,测量时间为10-30-5分钟,BSA-Su1498-VEGF&Su1498组。4)硝酸银染色内皮细胞的边界实验使用硝酸银灌注染色的内皮细胞边界的染色,它可以描绘出内皮细胞的紧密联接及相关蛋白,判断肿瘤细胞的位置。结果：1)VEGF增加肿瘤细胞对微血管的粘附结果显示VEGF显著增加的肿瘤细胞的粘附,粘附数量约增加了1.5倍2)Anti-VEGF和SU-1498显著降低了肿瘤细胞粘附,SU-1498阻滞了VEGF对粘附增加作用。3)VEGF增加微血管对溶质的通透性,SU-1498阻滞VEGF对增加微血管通透性的作用4)低速度肿瘤细胞粘附要明显高于正常速度组,同样显而易见高速度组粘附数量非常低,与正常速度组相比,5分钟后即有显著差异。5)肿瘤细胞粘附血管内内皮细胞的位置,总共读取粘附的肿瘤细胞328个,有301的肿瘤细胞粘附在内皮细胞的交接处,比例高达91.86%。结论：VEGF明显增加肿瘤细胞的粘附,VEGF的抗体以及受体阻滞剂减低了肿瘤细胞的粘附,SU-1498明显阻滞了VEGF对肿瘤粘附和大鼠肠系膜微血管的通透性,低速度粘附数量显著高于高速度肿瘤细胞的粘附,可能更多内皮细胞相互作用有关,肿瘤粘附血管的位置趋向于在内皮细胞的连接处,为肿瘤细胞溢出准备。第三部分肿瘤细胞粘附破坏微血管的EGL增加微血管通透性目的：探讨肿瘤细胞粘附微血管后,对微血管通透性的影响以及对血管结构EGL的改变。方法1)先通过肿瘤MDA-MB-231的灌注的确定其粘附时间,肿瘤粘附后测定微血管的流体静力传导率(Lp)和荧光白蛋白(FITC-BSA)通透性测定,分组为：对照组(Control):大鼠的肠系膜毛细血管后静脉,直接测定其毛细血管后静脉的Lp或P,测量灌注1%BSA在开始1、3、5、7、10、15分钟和45、47、50、52、55分钟左右,时间段测量各个值起始粘附组(Initialadhesion):肿瘤细胞起始粘附组定义试验进行过程粘附数是1/5000μm2及大约1001μm长度微血管中有一个细胞粘附,平均为5-10分钟,实时观察细胞粘附情况达到1/5000μm2,即开始测量Lp或者P,时间按持续10分钟。45分钟灌注粘附组(AfterPerfused45min)：肿瘤细胞灌注45分钟后,更换玻璃微针进行测量血管Lp或者P,测量时间约为10分钟2)数学模型的预测,运用内皮细胞间隙模型,进行预测得的Lp和P的结果3)微血管的EGL层抗硫酸乙酰肝素(Anti-HS)的免疫染色肿瘤灌注测量与Lp、P的分组基本相同,对照组、起始粘附组、45分钟灌注粘附组进行染色对比4)微血管经血清类粘蛋白(Orosomucoid,ORM)预处理后肿瘤细胞粘附和P测定和EGL的影响结果1)MDA-MBA-231微血管的粘附情况肿瘤起始粘附统计后的时间为6.96±0.75分钟,肿瘤粘附增加5个/5000gm2的时候,灌注的时间为39.4+3.64分钟,随灌注时间的增加,肿瘤细胞粘附也逐步增加。2)肿瘤细胞的粘附增加微血管水流体静力传导率Lp对照组相比起始粘附组、45分钟灌注粘附组的Lp分别增大了1.7±0.1和2.75±0.14倍。3)肿瘤细胞的粘附增加微血管的白蛋白的通透性肿瘤细胞粘附减低了微血管对白蛋白的反射系数σ,根据测定的σ,肿瘤细胞在起始粘附组的扩散通透系数(DiffusivePermeabilty,Pd),与正常对照组显比其增长了2.2±0.30。肿瘤细胞灌注45分钟后Pd与正常对照组增张了5.64±0.62倍。与Lp相比,白蛋白的通透性增长明显要大于Lp的增长。4)模型的预测根据测得的Lp和P的结果,与预测模型的相符合,肿瘤细胞初始粘附的时候,其EGL的厚度减少了其35-40左右%,当肿瘤细胞灌注45分钟后,EGL减少90%左右的厚度,结果是吻合。5)肿瘤细胞粘附破坏微血管的EGL层肿瘤粘附后,Anti-HS染色强度均有显著减低,与对照组相比起始粘附组减少了60.25%,而灌注45分钟组减少了82.75%,进一步证实肿瘤细胞破坏了EGL。7)微血管经血清类粘蛋白(Orosomucoid,ORM)预处理后肿瘤细胞粘附和P测定和EGL的影响经ORM预处理后,显著减低肿瘤细胞的粘附对微血管的粘附和减低了为微血管的通透性,而ORM测定的EGL的荧光强度增长1.38倍,ORM的粘蛋白对EGL有明显的重建和维持结构稳定作用,表明肿瘤细胞粘附与EGL的相互作用影响。结论通过数学模型的推断和通过微血管灌注对EGL的蛋白HS的免疫荧光染色,证实肿瘤细胞粘附微血管后破坏内皮细胞的屏障EGL,使血管的通透性增加,通过ORM保护灌注重建和稳定EGL的结构显著减少肿瘤细胞粘附和降低了微血管的通透性。保护EGL可能有效地防止肿瘤细胞微血管粘附的血源转移,为肿瘤转移提供新的治疗思路。
【作者】蔡斌；
【导师】钟世镇；付冰梅；
【作者基本信息】南方医科大学，人体解剖与组织胚胎学，2011，博士
【关键词】肿瘤细胞；微血管；粘附；内皮细胞生长因子；内皮细胞糖萼；

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